یکشنبه, 04 آبان 1393

انجمن علمی دانشجویان علوم آزمایشگاهی

اندازه گیری هموگلوبین

رای دهی:  / 4
ضعیفعالی 

 

هموگلوبین پروتئینی کونژوگه بوده که به عنوان حامل انتقال اکسیژن و دی اکسید کربن عمل میکند.

مشتقات هموگلوبین

1- مت هموگلوبین

نوعی هموگلوبین است که در آن آهن دو ظرفیتی اکسید شده و به حالت سه ظرفیتی در آمده و به همین دلیل توان ترکیب برگشت پذیر با اکسیژن را از دست داده است.

2-سولف هموگلوبین

سولف هموگلوبین ترکیبی از اشکال اکسید شده و نسبتا دناتوره شده ی هموگلوبین است که در طی فرآیند همولیز اکسیداتیو ایجاد می شود. این هموکروم سبز رنگ در طی اکسید شدن هموگلوبین و ورود اتم گوگرد به داخل حلقه های هم ایجاد می گردد.

3- کربوکسی هموگلوبین

در اثر ترکیب هموگلوبین با مونواکسید کربن به وجود می آید. ظرفیت اتصال مونواکسید کربن به هموگلوبین 210 برابر بیشتر از اکسیژن است.

روش اندازه گیری هموگلوبین

روش های متعددی جهت اندازه گیری هموگلوبین وجود دارد که عبارتند از:

1-اندازه گیری به روش رنگ سنجی

2-اندازه گیری قدرت و قابلیت محلول در اتصال با اکسیژن و مونواکسید کربن

3-اندازه گیری میزان آهن محلول و بدین طریق پی بردن به میزان هموگلوبین آن

اندازه گیری میزان هموگلوبین به روش رنگ سنجی

به کمک 4 تکنیک زیر می توان میزان هموگلوبین موجود در یک محلول را تعیین کرد.

1-سیان مت هموگلوبین: توصیه شده توسط کمیته ی بین المللی استاندارد سازی هماتولوژی (ICSH) بعنوان روش مرجع جهت اندازه گیری انواع هموگلوبین به جز سولف هموگلوبین.

2-اکسی هموگلوبین

3-هماتین قلیایی

4-هماتین اسیدی

روش سیانومت هموگلوبین

-         مواد و وسایل لازم

1-  محلول سیانومت هموگلوبین ( محلول درابکین)

2-  لوله آزمایش

3-  سمپلر

4-  اسپکتروفتومتر

5-  خون حاوی ضدانعقاد EDTA

محلول درابکین

محلول درابکین باعث سرعت بخشیدن به همولیز گلبول های قرمز می شود این محلول شامل مواد زیر است:

1

فری سیانید پتاسیم (K3Fe(CN)6)

2/0 گرم

2

سیانید پتاسیم (KCN)

05/0 گرم

3

دی هیدروژن پتاسیم فسفات (KH2PO4)

14/0  گرم

4

استروکس (دترجنت غیر یونی)

5/0تا 1 میلی لیتر

5

آب مقطر

1000  میلی لیتر

درابکین در دمای اتاق و در ظروف شیشه ی تیره برای چندین ماه پایدار است. این محلول با وجود داشتن سیانور (که بسیار ناچیز است) بی خطر است. محلول درابکین باید برنگ زرد روشن و صاف بوده و جذب نوری آن در طول موج 540 نانومتر با بلانک آب مقطر صفر باشد. میزان PH آن بین 4/7-7 است.

نکته: اگر PH درابکین خارج از محدوده ی طبیعی آن باشد، جذب نوری آن در 540 نانومتر صفر نباشد، و یا اینکه کدر شده و یا منجمد شود، دیگر قابل استفاده نبوده و باید دور ریخته شود.

اساس روش سیانومت هموگلوبین

خون ابتدا در محلول درابکین لیز و رقیق می شود. سپس فری سیانید پتاسیم، هموگلوبین را اکسید و به مت هموگلوبین تبدیل می نماید. سیانید پتاسیم، یون های سیانید را برای شکل گیری سیانومت هموگلوبین که در 540 نانومتر جذب دارد فراهم نموده و ترکیب سیانومت هموگلوبین را ایجاد میکند. جذب سیانومت هموگلوبین در طول موج540 نانومتر توسط اسپکترو فتومتر سنجیده شده و با جذب محلول استاندارد سیانومت هموگلوبین مقایسه می گردد.

منحنی استاندارد هموگلوبین

برای رسم منحنی به محلول استاندارد هموگلوبین نیاز است که به صورت تجاری در دسترس بوده و باید طبق دستورالعمل کیت رقت های مختلفی از آن تهیه گردد. در این منحنی، مقدار هموگلوبین بر حسب گرم بر دسی لیتر روی محورX ها و جذب نوری رقت های مختلف محلول استاندارد روی محور Y ها قرار دارد. منحنی رسم شده به صورت یک خط راست است.

روش دستی انجام آزمایش

1-در دو لوله آزمایش 5 میلی لیتر از محلول درابکین اضافه کنید.

2- به یکی از لوله ها 20 میکرولیتر از خون حاوی ضد انعقاد اضافه کنید.

3- محلول خون و درابکین را مخلوط کرده و بگذارید 10 دقیقه بماند.

4- بعد از 10 دقیقه با استفاده از اسپکتروفتومتر جذب لوله حاوی خون و درابکین را در مقابل محلول درابکین به عنوان بلانک اندازه گیری کنید.

5-  با استفاده از منحنی استاندارد و طول موج بدست آمده مقدار واقعی هموگلوبین را بدست آورید.

مقادیر طبیعی هموگلوبین در روش سيانومت هموگلوبين :

نوزادان

23-17 گرم در دسی لیتر

مردان

17-13 گرم در دسی لیتر

زنان   

16-12 گرم در دسی لیتر

موارد خطا

مهمترین منابع خطا که با افزایش کدورت درابکین باعث افزایش کاذب مقدار هموگلوبین می گردند عبارتند از:

-         کربوکسی هموگلوبین

-         هیپر لیپیدمی

-         کرایو گلوبولینمی

-         گلبول های قرمزی که لیز نمی شوند.

-         لکوسیتوز

-         هیپربیلی روبینمی

برای اندازه گیری صحیح هموگلوبین به روش دستی می توان اقدامات زیر را انجام داد:

1-چنانچه لکوسیتوز موجب کدورت محلول درابکین شده باشد، نمونه را سانتریفیوژ کرده و از محلول رویی استفاده کنید.

2-اگر افزایش پروتئین ها موجب کدورت محلول درابکین شده باشد ، با افزودن یک قطره آمونیوم 25% ترکیب خون با درابکین را شفاف کرده و از این محلول استفاده کنید.

3- چنانچه هایپرلیپیدمی موجب کدورت محلول شود، از محلول 10 میکرولیتر پلاسمای بیمار و 5 میلی لیتر محلول درابکین به عنوان بلانک استفاده کنید. 

4- چنانچه گلبول های لیز نشده موجب کدورت محلول درابکین شده باشد، با افزایش 5 سی سی محلول آب مقطر محلول را هیپوتونیک تر کرده و سپس مقدار هموگلوبین را در عدد 2 ضرب کنید.

 

 

 

منابع:

1-  کتاب مهارت های آزمایشگاهی در خون شناسی نوشته دکتر گل افشان

2-  کتاب اصول ، کاربرد و تفسیر آزمایشها در هماتولوژی عملی نوشته دکتر مهبد

3-  کتاب خون شناسی-انعقاد و طب انتقال خون هنری – دیویدسون 2011

 

با تشکر از دکتر علیرضا فارسی نژاد

  • هیچ نظری یافت نشد
افزودن نظر